內(nèi)標(biāo)法是一種間接或相對(duì)的校準(zhǔn)方法。在分析測(cè)定樣品中某組分含量時(shí)，加入一種內(nèi)標(biāo)物質(zhì)以校誰(shuí)和消除出于操作條件的波動(dòng)而對(duì)分析結(jié)果產(chǎn)生的影響，以提高分析結(jié)果的準(zhǔn)確度。
內(nèi)標(biāo)法在氣相色譜定量分析中是一種重要的技術(shù)。使用內(nèi)標(biāo)法時(shí)，在樣品中加入一定量的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，它可被色譜拄所分離，又不受試樣中其它組分峰的干擾，只要測(cè)定內(nèi)標(biāo)物和待測(cè)組分的峰面積與相對(duì)響應(yīng)值，即可求出待測(cè)組分在樣品中的百分含量。采用內(nèi)標(biāo)法定量時(shí)，內(nèi)標(biāo)物的選擇是一項(xiàng)十分重要的工作。理想地說(shuō)，內(nèi)標(biāo)物應(yīng)當(dāng)是一個(gè)能得到純樣的己知化合物，這樣它能以準(zhǔn)確、已知的量加到樣品中去，它應(yīng)當(dāng)和被分析的樣品組分有基本相同或盡可能一致的物理化學(xué)性質(zhì)(如化學(xué)結(jié)構(gòu)、極性、揮發(fā)度及在溶劑中的溶解度等)、色譜行為和響應(yīng)特征，最好是被分析物質(zhì)的一個(gè)同系物。當(dāng)然，在色譜分析條什下，內(nèi)標(biāo)物必須能與樣品中各組分充分分離。需要指出的是，在少數(shù)情況下，分析人員可能比較關(guān)心化臺(tái)物在一個(gè)復(fù)雜過程中所得到的回收率，此時(shí)，他可以使用一種在這種過程中很容易被完全回收的化臺(tái)物作內(nèi)標(biāo)，來(lái)測(cè)定感興趣化合物的百分回收率，而不必遵循以上所說(shuō)的選擇原則。
在使用內(nèi)標(biāo)法定量時(shí)，有哪些因素會(huì)影響內(nèi)標(biāo)和被測(cè)組分的峰高或峰面積的比值?
影響內(nèi)標(biāo)和被測(cè)組分峰高或峰面積比值的因素主要有化學(xué)方面的、色譜方面的和儀器方面的三類。
由化學(xué)方面的原因產(chǎn)生的面積比的變化常常在分析重復(fù)樣品時(shí)出現(xiàn)。
化學(xué)方面的因素包括：
1、內(nèi)標(biāo)物在樣品里混合不好；
2、內(nèi)標(biāo)物和樣品組分之間發(fā)生反應(yīng)，
3、內(nèi)標(biāo)物純度可變等。
對(duì)于一個(gè)比較成熟的方法來(lái)說(shuō)，色譜方面的問題發(fā)生的可能性更大一些，色譜上常見的一些問題(如滲漏)對(duì)絕對(duì)面積的影響比較大，對(duì)面積比的影響則要小一些，但如果絕對(duì)面積的變化已大到足以使面積比發(fā)生顯著變化的程度，那么一定有某個(gè)重要的色譜問題存在，比如進(jìn)樣量改變太大，樣品組分濃度和內(nèi)標(biāo)濃度之間有很大的差別，檢測(cè)器非線性等。進(jìn)樣量應(yīng)足夠小并保持不變，這樣才不致于造成檢測(cè)器和積分裝置飽和。如果認(rèn)為方法比較可靠，而色譜固看來(lái)也是正常的話，應(yīng)著重檢查積分裝置和設(shè)置、斜率和峰寬定位。對(duì)積分裝置發(fā)生懷疑的最有力的證據(jù)是：面積比可變，而峰高比保持相對(duì)恒定，
在制作內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)曲線時(shí)應(yīng)注意什么?
在用內(nèi)標(biāo)法做色譜定量分析時(shí)，先配制一定重量比的被測(cè)組分和內(nèi)標(biāo)樣品的混合物做色譜分析，測(cè)量峰面積，做重量比和面積比的關(guān)系曲線，此曲線即為標(biāo)準(zhǔn)曲線。在實(shí)際樣品分析時(shí)所采用的色譜條件應(yīng)盡可能與制作標(biāo)準(zhǔn)曲線時(shí)所用的條件一致，因此，在制作標(biāo)準(zhǔn)曲線時(shí)，不僅要注明色譜條件(如固定相、柱溫、載氣流速等)，還應(yīng)注明進(jìn)樣體積和內(nèi)標(biāo)物濃度。在制作內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)曲線時(shí)，各點(diǎn)并不完全落在直線上，此時(shí)應(yīng)求出面積比和重量比的比值與其平均位的標(biāo)準(zhǔn)偏差，在使用過程中應(yīng)定期進(jìn)行單點(diǎn)校正，若所得值與平均值的偏差小于2，曲線仍可使用，若大于2，則應(yīng)重作曲線，如果曲線在鉸短時(shí)期內(nèi)即產(chǎn)生變動(dòng)，則不宜使用內(nèi)標(biāo)法定量。

外標(biāo)法
用待測(cè)組分的純品作對(duì)照物質(zhì)，以對(duì)照物質(zhì)和樣品中待測(cè)組分的響應(yīng)信號(hào)相比較進(jìn)行定量的方法稱為外標(biāo)法。此法可分為工作曲線法及外標(biāo)一點(diǎn)法等。工作曲線法是用對(duì)照物質(zhì)配制一系列濃度的對(duì)照品溶液確定工作曲線，求出斜率、截距。在完全相同的條件下，準(zhǔn)確進(jìn)樣與對(duì)照品溶液相同體積的樣品溶液，根據(jù)待測(cè)組分的信號(hào)，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出其濃度，或用回歸方程計(jì)算，工作曲線法也可以用外標(biāo)二點(diǎn)法代替。通常截距應(yīng)為零，若不等于零說(shuō)明存在系統(tǒng)誤差。工作曲線的截距為零時(shí)，可用外標(biāo)一點(diǎn)法(直接比較法)定量。
外標(biāo)一點(diǎn)法是用一種濃度的對(duì)照品溶液對(duì)比測(cè)定樣品溶液中i組分的含量。將對(duì)照品溶液與樣品溶液在相同條件下多次進(jìn)樣，測(cè)得峰面積的平均值，用下式計(jì)算樣品中i組分的量：
　　　　　W＝A(W)／(A)　　　　　　
式中W與A分別代表在樣品溶液進(jìn)樣體積中所含i組分的重量及相應(yīng)的峰面積。(W)及(A)分別代表在對(duì)照品溶液進(jìn)樣體積中含純品i組分的重量及相應(yīng)峰面積。外標(biāo)法方法簡(jiǎn)便，不需用校正因子，不論樣品中其他組分是否出峰，均可對(duì)待測(cè)組分定量。但此法的準(zhǔn)確性受進(jìn)樣重復(fù)性和實(shí)驗(yàn)條件穩(wěn)定性的影響。此外，為了降低外標(biāo)一點(diǎn)法的實(shí)驗(yàn)誤差，應(yīng)盡量使配制的對(duì)照品溶液的濃度與樣品中組分的濃度相近。　
外標(biāo)法 external standard method
色譜分析中的一種定量方法，它不是把標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)加入到被測(cè)樣品中，而是在與被測(cè)樣品相同的色譜條件下單獨(dú)測(cè)定，把得到的色譜峰面積與被測(cè)組分的色譜峰面積進(jìn)行比較求得被測(cè)組分的含量。外標(biāo)物與被測(cè)組分同為一種物質(zhì)但要求它有一定的純度，分析時(shí)外標(biāo)物的濃度應(yīng)與被測(cè)物濃度相接近，以利于定量分析的準(zhǔn)確性。
定量分析中怎樣選擇內(nèi)標(biāo)法或外標(biāo)法
選一與欲測(cè)組分相近但能完全分離的組分做內(nèi)標(biāo)物（當(dāng)然是樣品中沒有的組分），然后配制欲測(cè)組分和內(nèi)標(biāo)物的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，進(jìn)樣得相對(duì)校正因子。再將內(nèi)標(biāo)物加入欲測(cè)組分的樣品中，進(jìn)樣后測(cè)得欲測(cè)組分和內(nèi)標(biāo)物的定量參數(shù)。用內(nèi)標(biāo)法公式計(jì)算即可。

內(nèi)標(biāo)法是將一定量的純物質(zhì)作內(nèi)標(biāo)物，加入到準(zhǔn)確稱量的試樣中，根據(jù)被測(cè)試樣和內(nèi)標(biāo)物的質(zhì)量比及其相應(yīng)的色譜峰面積之比，來(lái)計(jì)算被測(cè)組分的含量。
選擇內(nèi)標(biāo)物有4個(gè)要求：1.內(nèi)標(biāo)物應(yīng)是該試樣中不存在的純物質(zhì)；2.它必須完全溶于試樣中，并與試樣中各組分的色譜峰能完全分離；3.加入內(nèi)標(biāo)物的量應(yīng)接近于被測(cè)組分；4.色譜峰的位置應(yīng)與被測(cè)組分的色譜峰的位置相近，或在幾個(gè)被測(cè)組分色譜峰中間。
內(nèi)標(biāo)法的優(yōu)點(diǎn)是測(cè)定的結(jié)果較為準(zhǔn)確，由于通過測(cè)量?jī)?nèi)標(biāo)物及被測(cè)組分的峰面積的相對(duì)值來(lái)進(jìn)行計(jì)算的，因而在一定程度上消除了操作條件等的變化所引起的誤差。內(nèi)標(biāo)法的缺點(diǎn)是操作程序較為麻煩，每次分析時(shí)內(nèi)標(biāo)物和試樣都要準(zhǔn)確稱量，有時(shí)尋找合適的內(nèi)標(biāo)物也有困難。
外標(biāo)法簡(jiǎn)便，但進(jìn)樣量要求十分準(zhǔn)確，要嚴(yán)格控制在與標(biāo)準(zhǔn)物相同的操作條件下進(jìn)行，否則造成分析誤差，得不到準(zhǔn)確的測(cè)量結(jié)果。
內(nèi)標(biāo)與外標(biāo)都是定量的一種方法而已，至于哪一種方法好與不好不能一概而論，做不同的分析，面對(duì)著不同的要求，再加上分析成本分析效率等等問題，我想簡(jiǎn)單而有效進(jìn)行定量分析來(lái)滿足要求才是最重要的。
1、以前做過很多醫(yī)藥、農(nóng)藥中間體的芳香族鹵代化合物的常量定量分析，沒有自動(dòng)進(jìn)樣器，用外標(biāo)法定量，確實(shí)重現(xiàn)性與穩(wěn)定性非常差，結(jié)果經(jīng)常受到搞合成同事的質(zhì)疑。其實(shí)，仔細(xì)分析原因不一定就是外標(biāo)法不適合這種定量分析，首先我們的實(shí)驗(yàn)室儀器和手段是否調(diào)整到一種穩(wěn)定而合理的狀態(tài)了，比如，襯管是否潔凈，玻璃棉的位置是否合適恰當(dāng)（能否使樣品盡可能的汽化）、汽化溫度是否合適、色譜峰形是否對(duì)稱（也就是樣品與色譜柱健合相是否匹配）、附近有沒有其它色譜峰的干擾、選用什么進(jìn)樣方式（如快速進(jìn)樣還是熱針進(jìn)樣）等等因素的影響都需要考慮，如果這些因素都考慮了，按照GMP方法驗(yàn)證對(duì)于精密度的要求，同一樣品進(jìn)6針以上的RSD和配制6個(gè)樣品的定量結(jié)果RSD都能滿足小于1.5%的要求，那么這個(gè)方法用外標(biāo)法就是完全適用的，但是前面的影響因素是一定要都考慮到的，否則談?wù)撨@個(gè)方法是否適用就有失偏頗了。在做過的許多出口產(chǎn)品的定量分析方法當(dāng)中有許多是一些醫(yī)藥公司提供的比較完善而驗(yàn)證過的方法，內(nèi)標(biāo)與外標(biāo)都有（他們用的都是自動(dòng)進(jìn)樣）精密度都能滿足RSD小于1.5%的要求，當(dāng)一個(gè)方法能夠滿足測(cè)試要求的時(shí)候，無(wú)論內(nèi)標(biāo)外標(biāo)，都是可行的，當(dāng)然有一個(gè)分析成本和分析時(shí)間的問題，內(nèi)標(biāo)的成本和控制溶液、樣品溶液的配制當(dāng)然要比外標(biāo)要高和麻煩一些了。而有些時(shí)候，可能受你實(shí)驗(yàn)室現(xiàn)有儀器和附屬設(shè)備的影響，達(dá)不到一定的要求，而還必須進(jìn)行定量分析，有時(shí)外標(biāo)的結(jié)果可能就要差一些，這時(shí)，你可能就要考慮用內(nèi)標(biāo)法了，可以排除手動(dòng)進(jìn)樣的誤差、分流歧視的影響、包括一些未知因素平行誤差的影響，這時(shí)內(nèi)標(biāo)可能就顯示出它的優(yōu)勢(shì)來(lái)了。
2、上面已經(jīng)提到當(dāng)做方法驗(yàn)證的時(shí)候，當(dāng)同一樣品配制6個(gè)樣品溶液用所選用的外標(biāo)法進(jìn)行定量的時(shí)候，RSD都滿足1.5%的要求時(shí)，也分為兩種情況，小于1%和大于1%小于1.5%。如果RSD的結(jié)果小于1%，那這個(gè)方法就沒有什么可以懷疑的了；如果RSD的結(jié)果大于1%而在1.5%略低一些的范圍活動(dòng)時(shí)，這個(gè)方法的可行性就將受到質(zhì)疑，畢竟這是方法驗(yàn)證，你就要考慮上面1所提到的影響因素的影響了，如果排除掉以上的影響因素，RSD還是在1.5%附近，就要嘗試內(nèi)標(biāo)了，如果內(nèi)標(biāo)結(jié)果的RSD很好，就證明你的這個(gè)方法受實(shí)驗(yàn)條件的影響很大，只能用內(nèi)標(biāo)了，或者干脆將原方法做大的變動(dòng)，再嘗試用外標(biāo)法測(cè)試。
3、而對(duì)于微量分析，比如農(nóng)藥和獸藥殘留的分析、環(huán)境分析等，根據(jù)不同的限量標(biāo)準(zhǔn)要求對(duì)于精密度的要求也比常量分析的要求要寬松的多，RSD有時(shí)可以允許達(dá)到10%甚至更高，這時(shí)可能外標(biāo)法有更大的應(yīng)用空間。
4、單從精密度方面去考慮，排除其它成本和效率的因素，個(gè)人認(rèn)為還是內(nèi)標(biāo)優(yōu)于外標(biāo)。曾經(jīng)做過一個(gè)中間體二氨基丙醇的常量定量分析，以二乙醇胺為內(nèi)標(biāo)，RTX-5
amine（堿改性）
15m*0.32mm*1.0um色譜柱分析，將配制好的控制溶液（含有內(nèi)標(biāo)物）自動(dòng)進(jìn)樣器進(jìn)6針，目的物（二氨基丙醇）與內(nèi)標(biāo)物（二乙醇胺）峰面積比率的RSD為0.18%，而只對(duì)這六針樣品的目的物峰（二氨基丙醇）面積求RSD，結(jié)果為0.71%，通過這一實(shí)例的結(jié)果大家就會(huì)發(fā)現(xiàn)到底哪個(gè)方法精密度更好了，當(dāng)然是內(nèi)標(biāo)更好了。當(dāng)然這個(gè)化合物的檢測(cè)方法最后根據(jù)上面的驗(yàn)證數(shù)據(jù)用內(nèi)標(biāo)和外標(biāo)定量都是可以的，實(shí)驗(yàn)室可以自由選擇。但內(nèi)標(biāo)與外標(biāo)精密度結(jié)果的差異是顯然存在的事實(shí)。
結(jié)論：應(yīng)用外標(biāo)法能夠滿足要求，****還是外標(biāo)法了，畢竟簡(jiǎn)單而省事。對(duì)于精密度要求比較高、結(jié)果準(zhǔn)確度會(huì)產(chǎn)生重大影響、實(shí)驗(yàn)室條件不是很理想的等等條件下，用內(nèi)標(biāo)法還是必要的。無(wú)論應(yīng)用那種方法，方法的驗(yàn)證和確認(rèn)都是很重要的，只要是按照程序經(jīng)過驗(yàn)證和確認(rèn)的方法，都有其應(yīng)用的空間的。
外標(biāo)法
用被測(cè)化合物的純品作為標(biāo)準(zhǔn)樣品，配制成一系列的已知濃度的標(biāo)樣。
注入色譜柱的到其響應(yīng)值（峰面積）。
在一定范圍內(nèi)，標(biāo)樣的濃度與響應(yīng)值之間存在較好的線性關(guān)系，即W=f×A，制成標(biāo)準(zhǔn)曲線。
在完全相同的實(shí)驗(yàn)條件下，注入未知樣品，得到欲測(cè)組分的響應(yīng)值。
根據(jù)已知的系數(shù)f，即可求出欲測(cè)組分的濃度。
外標(biāo)法的優(yōu)點(diǎn)：
操作、計(jì)算簡(jiǎn)單，是一種常用的定量方法。
無(wú)需各組分都被檢出、洗脫。
需要標(biāo)樣。
標(biāo)樣及未知樣品的測(cè)定條件要一致。
進(jìn)樣體積要準(zhǔn)確。
內(nèi)標(biāo)法操作：
將已知量的內(nèi)標(biāo)樣加入標(biāo)準(zhǔn)樣品，制成混合標(biāo)樣，并配制一系列的已知濃度的工作標(biāo)樣�；旌蠘�(biāo)樣中標(biāo)樣與內(nèi)標(biāo)樣的摩爾比不變。
注入色譜柱，以（標(biāo)樣峰面積/內(nèi)標(biāo)樣峰面積）為響應(yīng)值。
根據(jù)響應(yīng)值與工作標(biāo)樣濃度之間存在的線性關(guān)系，即W=f×A，制成標(biāo)準(zhǔn)曲線。
將已知量的內(nèi)標(biāo)樣加入未知樣品，注入色譜柱，得到欲測(cè)組分的響應(yīng)值。
根據(jù)已知的系數(shù)f，即可求出欲測(cè)組分的濃度。
內(nèi)標(biāo)法的特點(diǎn)：
操作過程中樣品和內(nèi)標(biāo)是混合在一起注入色譜柱的，因此只要混合溶液中被測(cè)組分與內(nèi)標(biāo)的量的比值恒定，上樣體積的變化不會(huì)影響影響定量結(jié)果。
內(nèi)標(biāo)法抵消了上樣體積，乃至流動(dòng)相、檢測(cè)器的影響，因此比外標(biāo)法精確。